Acta NaturaeActa NaturaeActa Naturae2075-8251Acta Naturae Ltd1030010.32607/20758251-2019-11-1-23-28Research ArticlesЭкспериментальные статьиResearch ArticleIsolation, Purification and Characterization of L,D-transpeptidase 2 from Mycobacterium tuberculosisВыделение, очистка и характеристика L,D-транспептидазы 2 Mycobacterium tuberculosisBaldinS. M.БалдинС. M.
Russian Federation
vytas@belozersky.msu.ruShcherbakovaT. A.ЩербаковаT. A.
Russian Federation
vytas@belozersky.msu.ruŠvedasV. K.ШвядасВ. K.
Russian Federation
vytas@belozersky.msu.ruLomonosov Moscow State UniversityМосковский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. БелозерскогоLomonosov Moscow State UniversityМосковский государственный университет им. М.В. Ломоносова15032019111VOL 11, NO1 (2019)ТОМ 11, №1 (2019)232817012020Copyright ©; 2019, Baldin S.M., Shcherbakova T.A., Švedas V.K.Copyright ©; 2019, Балдин С.M., Щербакова T.A., Швядас В.K.2019Baldin S.M., Shcherbakova T.A., Švedas V.K.Балдин С.M., Щербакова T.A., Швядас В.K.https://creativecommons.org/licenses/by/4.0https://actanaturae.ru/2075-8251/article/view/10300

L,D-transpeptidase 2 from Mycobacterium tuberculosis plays a key role in the formation of nonclassical 3-3 peptidoglycan cross-links in a pathogen’s cell wall making it resistant to a broad range of penicillin antibiotics. The conditions of cultivation, isolation, and purification of recombinant L,D-transpeptidase 2 from M. tuberculosis have been optimized in this study. Oxidation of the free SH groups of catalytic cysteine Cys354 is an important factor causing the inactivation of the enzyme, which occurs during both the expression and storage of enzyme preparations. The biochemical characteristics of purified L,D-transpeptidase 2 and L,D-transpeptidase 2 lacking domain A were determined; the kinetic constants of enzyme-catalyzed nitrocefin transformation were evaluated.

L,D-транспептидаза типа 2 Mycobacterium tuberculosis играет ключевую роль в формировании неклассических 3-3-поперечных сшивок пептидогликана в клеточной стенке патогена, обуславливая его устойчивость к широкому спектру антибиотиков пенициллинового ряда. Нами оптимизированы условия экспрессии, выделения и очистки рекомбинантной L,D-транспептидазы 2 из M. tuberculosis. Важным фактором, вызывающим инактивацию фермента, является окисление SH-групп каталитического остатка цисте ина Cys354 как в процессе экспрессии, так и при хранении препарата. Определены биохимические свойства очищенной L,D-транспептидазы 2 - как полной, так и без домена А, а также кинетические характеристики катализируемой ферментом реакции превращения нитроцефина.

L,D-transpeptidaseMycobacterium tuberculosisenzyme purificationrecombinant enzymeenzyme reactivationL,D-транспептидазаMycobacterium tuberculosisочистка ферментарекомбинантный ферментреактивация ферментаThis work was financially supported by the Russian Science Foundation (grant No. 15-14-00069).Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 15-14-00069).[1] // Global tuberculosis report 2016 // World Health Organization. 2016[2] Betts J.C., Lukey P.T., Robb L.C., McAdam R.A., Duncan K. // Mol. Microbiol. 2002, V.43, №3, P.717-731[3] Fisher J.F., Meroueh S.O., Mobashery S. // Chem. Rev. 2005, V.105, №2, P.395-424[4] Jankute M., Cox J.A.G., Harrison J., Besra G.S. // Annu. Rev. Microbiol. 2015, V.69, №1, P.405-423[5] Magnet S., Dubost L., Marie A., Arthur M., Gutmann L. // Journal of Bacteriology 2008, V.190, №13, P.4782-4785[6] Bielnicki J., Devedjiev Y., Derewenda U., Dauter Z., Joachimiak A., Derewenda Z.S. // Proteins Struct. Funct. Genet. 2006, V.62, №1, P.144-151[7] Biarrotte-Sorin S., Hugonnet J.E., Delfosse V., Mainardi J.L., Gutmann L., Arthur M., Mayer C. // J. Mol. Biol. 2006, V.359, №3, P.533-538[8] Böth D., Steiner E.M., Stadler D., Lindqvist Y., Schnell R., Schneider G. // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2013, V.69, №3, P.432-441[9] Kim H.S., Im H.N., An D.R., Yoon J.Y., Jang J.Y., Mobashery S., Hesek D., Lee M., Yoo J., Cui M. // J. Biol. Chem. 2015, V.290, №41, P.25103-25117[10] Gupta R., Lavollay M., Mainardi J.L., Arthur M., Bishai W.R., Lamichhane G. // Nat. Med. 2010, V.16, №4, P.466-469[11] Erdemli S.B., Gupta R., Bishai W.R., Lamichhane G., Amzel L.M., Bianchet M.A. // Structure. 2012, V.20, №12, P.2103-2115[12] Kim H.S., Kim J., Im H.N., Yoon J.Y., An D.R., Yoon H.J., Kim J.Y., Min H.K., Kim S.J., Lee J.Y. // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2013, V.69, №3, P.420-431[13] Correale S., Ruggiero A., Capparelli R., Pedone E., Berisio R. // Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 2013, V.69, №9, P.1697-1706[14] Dubée V., Triboulet S., Mainardi J.L., Ethève-Quelquejeu M., Gutmann L., Marie A., Dubost L., Hugonnet J.E., Arthur M. // Antimicrob. Agents Chemother. 2012, V.56, №8, P.4189-4195[15] Dhar N., Dubeé V., Ballell L., Cuinet G., Hugonnet J.E., Signorino-Gelo F., Barros D., Arthur M., McKinney J.D. // Antimicrob. Agents Chemother. 2015, V.59, №2, P.1308-1319[16] Baldin S., Misiura N., Švedas V.K. // Acta Naturae. 2017, V.9, №1, P.44-51[17] // Purification of His-tag proteins. // MACHEREY-NAGEL. 2014. 2014[18] Itzhaki R.F., Gill D.M. // Anal. Biochem. 1964, V.9, №4, P.401-410[19] Ellman G.L. // Arch. Biochem. Biophys. 1959, V.82, №1, P.70-77