Галанин уменьшает ишемическое/реперфузионное повреждение сердца у крыс со стрептозотоциновым диабетом

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК – активные формы кислорода; АЭЗ – аденилатный энергетический заряд; ДК – дыхательный контроль; ЗР – зона риска; ИМ – инфаркт миокарда; ИРП – ишемическое/реперфузионное повреждение; КК-МВ – креатинкиназа-МВ; ЛДГ – лактатдегидрогеназа; ЛЖ – левый желудочек; мт-КК – митохондриальная креатинкиназа; ОФ – окислительное фосфорилирование; ЛНА – левая нисходящая коронарная артерия; ПОЛ – перекисное окисление липидов; СД – сахарный диабет; СТЗ – стрептозотоцин; Cr – креатин; G – галанин; PCr – фосфокреатин; ∑AN – общий пул адениннуклеотидов; ∑Cr – общий креатин.

ВВЕДЕНИЕ

Проблема коморбидности сахарного диабета и ишемической болезни сердца как двух распространенных патологий является одной из важнейших в современной экспериментальной и клинической кардиологии, учитывая их взаимное негативное влияние на прогноз и качество жизни больных. У пациентов с сахарным диабетом чаще возникают окклюзии коронарных артерий, а сердце более чувствительно к ишемическому и реперфузионному повреждению (ИРП), чем у пациентов без диабета [1]. Как правило, защита сердца от ИРП миокарда при диабете оказывается неэффективной [2]. Это вызвано дефектами в сигнальных каскадах PI3K/Akt и JAK2/STAT3, ключевых для защиты миокарда [3]. Диабетическая гипергликемия может вызывать дисфункцию митохондрий за счет увеличения экспрессии динамин-связанного белка 1 [4], блокирования митохондриальных АТР-зависимых K+-каналов [5] и инактивации фактора-1α, индуцируемого гипоксией (HIF-1α) [6]. Перечисленные метаболические изменения способствуют десенсибилизации диабетического миокарда к терапевтическим вмешательствам против ИРП. В связи с этим актуален поиск новых фармакологических мишеней для профилактики и лечения ИРП миокарда при диабете.

В последнее время важную роль в регуляции функции сердца при патологических состояниях отводят галанинергической системе [7]. Нейропептид галанин (GWT­LNSAGYL­LGPH­AIDN­H­RS­FSD­KHG­LT-NH2) широко представлен в центральной и периферической нервной системе, а также в других тканях [8]. В периферических органах, включая сердце, G действует не только через нейрональные механизмы, но и активирует семейство трансмембранных рецепторов GalR1-3 [9]. Недавно мы показали, что внутривенное введение G крысам после региональной ишемии миокарда значительно снижало некротическое повреждение кардиомиоцитов [10]. Этот эффект был опосредован активацией рецептора GalR2 и значительно снижался под влиянием М871, антагониста GalR2 [11]. Уменьшение размеров инфаркта миокарда (ИМ) под действием G сопровождалось снижением образования аддукта гидроксильных радикалов 5,5-диметил-пирролин-N-оксид-ОН и продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в зоне риска (ЗР) при возобновлении кровотока. G способен также ингибировать свободнорадикальное окисление липопротеинов низкой плотности в плазме крови человека [12]. Существенно, что G предотвращал развитие гипергликемии при стрептозотоциновом (СТЗ) диабете у крыс, улучшал метаболическое состояние сердца диабетических животных благодаря повышению дыхательной функции митохондрий и снижал образование продуктов ПОЛ в плазме крови [13]. Мы предположили, что этот пептид, улучшающий образование энергии в митохондриях сердца и снижающий окислительный стресс, может быть перспективным для снижения ИРП сердца при СД1. Ранее влияние G на ишемизированный миокард, подвергнутый воздействию диабета, не изучалось. Для проверки этой гипотезы G был использован в период реперфузии после региональной ишемии миокарда у крыс с гипергликемией, вызванной введением СТЗ. В этой работе критериями повреждения сердца служили размеры ИМ и активность маркеров некроза – креатинкиназы-МВ (КК-МВ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) – в плазме. Для понимания механизмов действия G акцент сделали на энергетическом состоянии ЗР и функции митохондрий, которая была охарактеризована параметрами дыхания волокон миокарда, скинированных сапонином.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Реагенты

Производные Fmoc-защищенных аминокислот были приобретены у Novabiochem и Bachem (Швейцария), реагенты для синтеза пептидов – у компании Fluka Chemie GmbH (Швейцария). Ферменты и химические препараты для определения метаболитов и параметров дыхания волокон миокарда приобретены у ООО «Мерк Лайф Сайенс» (Россия). Растворы готовили с использованием деионизированной воды (Millipore Corp., США).

Cинтез и хроматография пептида G

Пептид G получен конвергентным синтезом на твердой фазе путем конденсации пептидных блоков, полученных на полимере и в растворе, и очищен с помощью препаративной ВЭЖХ до 98% чистоты на хроматографе Knauer (Германия) с колонкой (30 × 250 мм) Kromasil 100-10 ODS (Швеция) [14]. Аналитическую ВЭЖХ проводили на колонке Kromasil 100-5 C18 (4.6 × 250 мм), размер частиц сорбента 5 мкм; в качестве элюентов использовали: буфер А – 0.1% TFA, буфер Б – 80% ацетонитрил в буфере А, элюция проводилась линейным градиентом от 20 до 80% Б за 30 мин со скоростью 1 мл/мин, детекция при λ = 220 нм (Приложения, рис. S1). Структуру пептида подтверждали методом масс-спектрометрии MALDI-TOF/TOF на приборе UltrafleXtreme Bruker Daltonics GmbH (Германия), оснащенном УФ-лазером (Nd) (Приложения, рис. S2). Характеристики пептида G приведены в табл. 1.

 

Таблица 1. Характеристики нейропептида G

Аминокислотная последовательность	Мол. масса, г/моль	MALDI-TOF, m/z	Растворимость в воде, мг/мл	Чистота, ВЭЖХ, %
GWTLNSAGYLLGPHAIDNHRSFSDKHGLT-NH2	3164.45	3163.474 [M + H]+	>40	98.10

 

Дизайн эксперимента

В работе использовали крыс-самцов Вистар массой 280–290 г, полученных из питомника животных «Столбовая» Научного центра биомедицинских технологий (Москва, Россия). Животных содержали в индивидуальных клетках при температуре 20–25°С с естественным циклом света и темноты, они имели свободный доступ к стандартному гранулированному рациону и воде. Перед исследованием всех животных взвешивали. После 24-часового голодания у 10 крыс забирали кровь из хвостовой вены для определения концентрации глюкозы и активности КК-МВ и ЛДГ в плазме. Затем крыс наркотизировали 2,2,2-трибромэтанолом (1 мг/кг в/б авертин, «Мерк», Россия) и выделяли сердца для определения показателей энергетического обмена (n = 5) и параметров дыхания митохондрий в волокнах левого желудочка (ЛЖ) сердца (n = 5) (исходное состояние – группа ИС). Оставшихся крыс распределяли случайным образом на пять групп по 15 крыс в каждой: контроль (К), ИРП сердца (ИР); диабет (Д), диабет с последующим ИРП сердца (Д+ИР), диабет с ИРП сердца и с введением G на реперфузии (Д+ИРG). В группе ИР повреждение сердца моделировали окклюзией левой нисходящей коронарной артерии (ЛНА) и последующей реперфузией [11]. Острый СД1 вызывали однократной инъекцией СТЗ (60 мг/кг, в/в) [15]. О развитии диабета судили по повышению уровня глюкозы в крови до 12 мМ и выше через 2 дня после инъекции СТЗ. Уровень глюкозы не снижался в течение 16 дней эксперимента у всех животных, получавших CТЗ. Группа Д+ИР получала однократную инъекцию СТЗ (60 мг/кг, в/в). Животных этой группы после 16-дневного эксперимента подвергали окклюзии ПНА и реперфузии, такой же длительности, как в группе ИР. Животным группы Д+ИРG вводили однократно СТЗ (60 мг/кг, в/в) и через 16 дней моделировали ИРП. Пептид G в физиологическом растворе вводили в/в в дозе 1 мг/кг болюсом в начале реперфузии. Доза G была выбрана на основе наших предыдущих результатов [11]. Крысы контрольной группы получали однократную в/в инъекцию 0.1 М цитратного буфера рН 4.5 (растворитель СТЗ). Массу тела и уровень глюкозы в крови животных экспериментальных групп определяли еженедельно. После 16-дневного исследования образцы крови собирали из хвостовой вены у крыс всех групп для определения активности КK-MB и ЛДГ в плазме. В сердце пяти животных из групп ИР, Д+ИР и Д+ИРG гистохимическим методом оценивали размеры ЗР и ИМ. У пяти крыс из экспериментальных групп после анестезии авертином (1 мг/кг, в/б) выделяли сердце и замораживали его в жидком азоте с использованием щипцов Волленбергера для последующего анализа метаболитов. Оставшихся пять животных из этих групп использовали для определения параметров дыхания митохондрий в волокнах левого желудочка (ЛЖ) сердца. Схема экспериментального протокола показана на рис. 1.

 

Рис. 1. Схема протокола опытов. Д – крысы получали в/в инъекцию СТЗ (60 мг/кг в 0.1 М цитратном буфере рН 4.5); Д+ИР – диабетические крысы (CТЗ 60 мг/кг, в/в), подвергнутые региональной ишемии и реперфузии сердца; Д+ИРG – диабетические крысы (CТЗ 60 мг/кг, в/в), подвергнутые региональной ишемии и реперфузии сердца, получавшие G (в/в в дозе 1 мг/кг болюсом в начале реперфузии). Цитр. буф. – 0.1 М цитратный буфер рН 4.5; CТЗ – стрептозотоцин

 

Модель региональной ишемии и реперфузии сердца крысы

Крыс групп ИР, Д+ИР и Д+ИРG наркотизировали 20% уретаном (1200 мг/кг веса, в/б) и в условиях торакотомии осуществляли искусственную вентиляцию легких комнатным воздухом с помощью аппарата KTR-5 (Hugo Sacks Electronik, Германия). Контролировали среднее артериальное давление и частоту сокращений сердца. Показатели записывали в ходе опыта с помощью аналого-цифрового преобразователя USB 6210 (National Instruments, США) и программы в системе LabView 7 (National Instruments). После окончания препарирования следовал период стабилизации гемодинамических показателей (30 мин). Затем животных подвергали 40-минутной окклюзии ЛНА с последующей 60-минутной реперфузией. Животным группы Д+ИРG одновременно с началом реперфузии в/в болюсом вводили пептид G в дозе 1.0 мг/кг веса. В группах ИР и Д+ИР после периода региональной ишемии в/в болюсом вводили такой же объем физиологического раствора. В конце опыта для идентификации ЗР и интактной области миокарда реокклюдировали ЛНА и в яремную вену вводили 2 мл 2% раствора Эванса. Затем вырезали сердце и выделяли левый желудочек (ЛЖ) для определения размеров ИМ.

Определение размеров инфаркта миокарда

Замороженный ЛЖ разрезали перпендикулярно длинной оси сердца на 4–5 срезов толщиной около 1.5–2.0 мм, которые затем инкубировали в течение 10 мин в 1% растворе 2,3,5-трифенилтетразолий хлорида в 0.1 М калий-фосфатном буфере (рН 7.4 при 37°С). Полученные образцы сканировали, площади ИМ и ЗР определяли методом компьютерной планиметрии, используя программу ImageJ (NIH, США). После этого срезы взвешивали для определения массы ЛЖ. В каждой группе рассчитывали отношения ЗР/ЛЖ и ИМ/ЗР в % [11].

Оценка повреждения мембран кардиомиоцитов

Повреждение мембран кардиомиоцитов оценивали по увеличению активности ЛДГ и КK-МВ в плазме крови. Около 0.5 мл крови собирали в гепаринизированные пробирки из венозного катетера в исходном состоянии (перед окклюзией ПНА) и после 1 ч реперфузии. Активность ферментов в плазме определяли с использованием наборов фирмы BioSystems на спектрофотометре Shimadzu UV-1800 (Япония) при λ = 340 нм.

Дыхание пермеабилизированных волокон миокарда

Пермеабилизированные сапонином волокна из ЛЖ сердца крысы получали по модифицированному методу [16]. Параметры дыхания волокон ЛЖ оценивали с использованием субстратов комплекса I – 10 мМ глутамата и 5 мМ малата – с помощью системы Oxygraph plus (HansaTech Instruments, Великобритания) и выражали в нмоль O2/мин/мг сухого веса. Скорость дыхания в состоянии 3 (V3) достигалась добавлением 2 мМ АDP. Сухую массу волокон определяли после сушки в течение ночи при 95°С. Параметры дыхания каждого образца волокон ЛЖ измеряли дважды. Дыхание в состоянии 2 (V2) оценивали по скорости потребления кислорода после добавления 10 мМ глутамата и 5 мМ малата без АDP. Функцию митохондрий оценивали по величине дыхательного контроля (ДК), который рассчитывали как отношение V3/V2. Целостность внешней мембраны митохондрий оценивали, добавляя 10 мкМ цитохрома с после максимальной стимуляции дыхания 2 мМ ADP, и выражали отношением Vcyt c/VADP в %. Степень функционального сопряжения митохондриальной креатинкиназы (мт-КК) с окислительным фосфорилированием (ОФ) оценивали, добавляя 30 мМ Сr к волокнам в присутствии субмаксимальной концентрации АDP (0.1 мМ), и рассчитывали как отношение (VCr – VADP)/VADP (%) [17].

Определение содержания метаболитов в зоне риска сердца

По окончании реперфузии ЗР быстро выделяли из ЛЖ и замораживали щипцами Волленбергера, охлажденными в жидком азоте. Замороженную ткань гомогенизировали в холодной 6% HClO4 (10 мл/г ткани) в гомогенизаторе Ultra-Turrax T-25 (IKA-Labortechnik, Германия). Белки осаждали центрифугированием (центрифуга Sorvall RT1, Thermo Fisher Scientific, США) при 2800 g в течение 10 мин при 4°С. Супернатанты нейтрализовали 5 М К2СО3 до рН 7.4. Осадок KСlO4 отделяли центрифугированием в тех же условиях. Безбелковые экстракты хранили при -70°С до определения метаболитов. Сухой вес гомогенизированной ткани определяли после высушивания образцов в течение суток при 110°С. Содержание АTP, АDP, АMP, PCr и Cr в тканевых экстрактах определяли модифицированными энзиматическими методами [18], используя спектрофотометр Shimadzu UV-1800 (Япония).

Статистическая обработка данных

Использован пакет программ SigmaPlot 11.2 (SysStat, США). Значения представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (М ± m). Различия между группами подтверждены статистически с применением дисперсионного анализа (ANOVA). При сравнении нескольких групп с контролем использован t-критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони. Отличия считали статистически значимыми при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Масса тела и уровень глюкозы в крови

В исходном состоянии (1-й день эксперимента) масса крыс достоверно не различалась между группами (табл. 2). В контрольной группе за период наблюдения происходило прогрессивное увеличение массы тела животных. У крыс диабетической группы не выявлено прибавления массы тела на 9-й день исследования (через неделю после повышения содержания глюкозы в крови выше 12 мМ под действием СТЗ). В конце исследования у животных этой группы масса тела была в среднем на 11.8 и 22.1% ниже, чем в исходном состоянии и в контроле (p < 0.02 и p < 0.001 соответственно). Сходное изменение массы тела отмечено у животных групп Д+ИР и Д+ИРG. Не обнаружено различий в массе тела животных диабетических групп в последний день исследования перед моделированием ИР повреждения сердца и введением пептида G.

 

Таблица 2. Изменения массы тела и концентрации глюкозы в крови животных изученных групп в течение эксперимента

Группа	Масса тела, г
	1-й день	9-й день	16-й день
К	326.2 ± 11.7	344.2 ± 3.5	379.2 ± 4.5*
Д	335.2 ± 2.5	348.7 ± 3.3*	295.5 ± 14.5*$ @
ИР	340.6 ± 3.6	-	-
Д+ИР	338.2 ± 1.7	376.5 ± 2.6*@	291.3 ± 4.6*$ @
Д+ИРG	336.2 ± 2.3	380.0 ± 4.3*@ #	321.2 ± 13.0 $@+
Глюкоза крови, мМ
К	6.1 ± 0.2	-	6.3 ± 0.2
Д	5.3 ± 0.5	22.4 ± 0.8*	23.8 ± 1.7*@
ИР	5.1 ± 0.4	-	-
Д+ИР	4.9 ± 0.6	26.8 ± 3.3*	21.3 ± 5.1*@
Д+ИРG	5.0 ± 0.2	25.0 ± 2.0*	21.5 ± 3.3*@

Данные представлены как М +m (n = 15). p < 0.05 от: * показателя в 1-й день, $ показателя на 9-й день, @ контроля, # Д, + Д+ИР.

 

В исходном состоянии не было достоверной разницы между концентрацией глюкозы в крови животных всех групп. Введение СТЗ повышало уровень глюкозы по сравнению с контролем в течение всего эксперимента. Через 16 дней концентрация глюкозы в крови животных группы Д в 4.5 раза превышала исходный уровень (p < 0.001) и в 3.8 раза значения в контрольной группе (p < 0.001). Аналогичные изменения этого показателя наблюдали в группах Д+ИР и Д+ИРG. Статистически значимых различий в уровне глюкозы в обеих диабетических группах перед моделированием ИР повреждения сердца не было.

Влияние диабета и пептида G на размеры инфаркта миокарда

Гистохимический анализ срезов ЛЖ сердца в конце реперфузии не выявил различий в размерах ЗР между группами ИР, Д+ИР и Д+ИРG (рис. 2). Величина ЗР/ЛЖ в этих группах была близкой и составляла в среднем 41.3 ± 1.3%. Это означает, что моделирование ИР повреждения сердца было стандартным у всех животных. В группе ИР величина инфаркта, выраженная отношением ИМ/ЗР составила 43.4 ± 1.6%. Под действием СТЗ размеры ИМ увеличивались и к окончанию эксперимента были в 1.4 раза больше этого показателя, чем в группе ИР (p = 0.002). Реперфузия с G значительно снижала ИМ/ЗР у диабетических крыс: в группе Д+ИРG этот показатель был на 40% ниже, чем в группе Д+ИР. На рис. 2В показана локализация некротической зоны в срезах ЛЖ после их окрашивания ТФТ. Увеличение образования пигмента красного цвета формазана в результате восстановления ТФТ NAD+ и NADP+-зависимыми дегидрогеназами в группе Д+ИРG указывает на снижение инфаркта под действием G.

 

Рис. 2. Размеры зоны риска (A), инфаркта миокарда (Б) срезы ЛЖ (В), окрашенные 2,3,5-трифенилтетразолий хлоридом в конце реперфузии, в группах с региональной ишемией и реперфузией. Показаны M±m для групп из пяти животных. p < 0.05 по сравнению с: ^ ИР, + Д+ИР

 

Активность КK-MB и ЛДГ в плазме крови

Активности КК-МВ и ЛДГ у крыс контрольной группы не отличались от значений в исходном состоянии (рис. 3А,Б). Развитие диабета в результате введения СТЗ приводило к значимому увеличению активности КК-МВ и ЛДГ к окончанию эксперимента по сравнению с контролем (p = 0.027 и p = 0.046 соответственно). Моделирование ИР повреждения сердца значительно увеличивало активности КК-МВ и ЛДГ к окончанию реперфузии по сравнению с этими показателями в контроле (p < 0.001). Эти значения были соответственно в 2.0 и 4.4 раза выше, чем в диабетической группе (p < 0.001). Региональная ишемия и реперфузия сердца у диабетических животных группы Д+ИР не вызывала значимого увеличения активности маркеров некроза по сравнению с группой ИР. Болюсное в/в введение G в начале реперфузии снижало активность КК-МВ по сравнению с этим показателем в группе Д+ИР в 1.4 раза (p = 0.006). Активность ЛДГ в группе Д+ИРG под действием G по сравнению с этим показателем в группе Д+ИР снижалась недостоверно (p = 0.085).

 

Рис. 3. Активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ, А) и креатинкиназы-МВ (КК-МВ, Б) в плазме крови крыс. Представлены значения M±m для групп из пяти животных. p < 0.05 по сравнению с: * К, # Д, + Д+ИР

 

Параметры дыхания волокон миокарда, скинированных сапонином

После 16 дней эксперимента отсутствовали различия в скорости дыхания в состоянии 2, состоянии 3, величине ДК и степени функциональной связи мт-КK с OФ между этими показателями в контрольной группе и в исходном состоянии (pис. 4). У крыс, получавших СТЗ, наблюдалось снижение V2 и особенно V3 (на 28 и 60% по сравнению с контролем соответственно, p < 0.05 и p < 0.001). Результатом этого было двукратное снижение ДК (p < 0.001). Степень функциональной активности мт-КК, оцененная в Cr-тесте, у животных с диабетом снижалась в 1.6 раза по сравнению с контролем (p < 0.001). Сходные изменения дыхательной функции митохондрий ЗР вызывало ИРП сердца. Средние значения параметров дыхания в этом случае не отличались значимо от значений в группе Д. Совместное воздействие СТЗ и ИРП ухудшало дыхание в состоянии 2 и 3 по сравнению с этими показателями у крыс диабетической группы (p = 0.038 и p < 0.01 соответственно) и у животных с ИРП (p = 0.022 и p = 0.004 соответственно). Это приводило к уменьшению ДК по сравнению с группой Д и ИР (p = 0.037 и p = 0.05 соответственно). Функциональная активность мт-КК в группе Д+ИР была заметно ниже, чем в группах Д и ИР, однако различия между этими группами были статистически недостоверными. Введение пептида G диабетическим животным после региональной ишемии миокарда увеличивало максимальное АDP-стимулированное состояние 3 и ДК в 2.3 и 1.6 раза по сравнению с этими показателями в группе Д+ИР (p = 0.011 и p = 0.022 соответственно). Функциональная связь мт-КК с ОФ в группе Д+ИРG возрастала в 2.4 раза по сравнению с группой Д+ИР. Репрезентативные протоколы дыхания, демонстрирующие изменения в состоянии 3 в изученных группах, показаны в Приложениях (рис. S3). Добавление 10 мкМ цитохрома с не влияло на АDP-стимулированное дыхание в группах Д, Д+ИР и Д+ИРG в конце эксперимента по сравнению с контролем. Процентное отношение Vcyt c/VADP в этих группах составило в среднем 103.5 +1.9 %, что свидетельствует об отсутствии повреждения наружной мембраны МХ под влиянием СТЗ и ИР.

Энергетическое состояние миокарда

В контроле содержание ATP, ADP, AMP, PCr и Cr в ЛЖ сердца после 16-дневного эксперимента не отличалось статистически значимо от исходных величин (табл. 3). У животных диабетической группы отмечено достоверное снижение содержания ATP, ∑AN, PCr и ∑Cr по сравнению с этими показателями в контроле (p < 0.05–0.001). Более сильное воздействие на АТР и ∑AN в ЗР оказывало ИРП сердца. В этом случае снижение этих параметров было в среднем в 1.3 раза больше, чем в контроле (p < 0.003 и p < 0.002 соответственно). Введение СТЗ и последующая региональная ишемия и реперфузия сердца увеличивали потери АТР и ∑AN в ЗР по сравнению с этими показателями в сердце животных диабетической группы (p = 0.001 и p = 0.008 соответственно). Эти изменения в содержании адениннуклеотидов приводили к снижению аденилатного энергетического заряда (АЭЗ) кардиомиоцитов по сравнению со снижением в группах Д и ИР (p < 0.01 и p < 0.001 соответственно). Отсутствовали достоверные изменения в cистеме PCr–Cr в ЗР животных группы Д+ИР по сравнению с группами Д и ИР. Введение пептида G животным диабетической группы в начале реперфузии улучшало энергетическое состояние ЗР к окончанию реперфузии. Это проявлялось в поддержании более высокого уровня ATP и ∑AN по сравнению с этими показателями в группе Д+ИР (в 1.4 и 1.25 раза, p = 0.023 и p = 0.04 соответственно) и достоверно более высокому АЭЗ кардиомиоцитов (p = 0.022). Под действием пептида G содержание ∑Cr в ЗР было выше, чем группе Д+ИР (p = 0.007) и достоверно не отличалось от значения в контроле.

 

Таблица 3. Энергетическое состояние миокарда крыс в изученных группах

Показатель	ИС	К	Д	ИР	Д+ИР	Д+ИРG
ATP	20.16+1.27	19.16+1.56	14.53+1.21*	10.34+1.45*	8.11+0.44*#	11.27+1.04*+
ADP	5.47+0.43	5.36+0.53	4.93+0.68	4.54+0.51	4.98+0.27	5.69+0.34
AMP	1.03+0.14	1.13+0.24	1.02+0.27	0.97+0.14	1.75+0.28^	2.20+0.15*#^
∑AN	26.66+1.87	25.68+1.90	20.43+1.24*	15.86+1.12*#	14.83+1.02*#	18.68+1.35*+
АЭЗ	0.85+ 0.01	0.85+0.02	0.82+0.01	0.79+0.02	0.71+0.01*#^	0.75+0.01*#+
PCr	25.34+1.98	25.29+1.39	15.62+0.95*	13.86+2.02*	17.06+1.54*	18.89+1.25*
Cr	37.21+2.77	34.98+1.36	32.54+2.77	31.54+2.67	30.57+1.47	34.42+2.41
∑Cr	62.55+2.15	60.27+1.37	48.16+2.03*	45.40+2.33*	47.63+0.74*	52.86+1.26+^

Данные представлены как М+m (n=5) и выражены для метаболитов в мкмоль/г сух. веса. ИС – исходное состояние. ∑АN = АТP+АDP+АМP; АЭЗ = (АТP+0.5 АDP)/∑АN; ∑Cr= РCr+Cr. p < 0.05 от: * К и ИС, # Д, ^ИР, + Д+ИР.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Моделирование СД1 у крыс введением СТЗ помимо гипергликемии и отсутствия прироста массы тела сопровождалось истощением запасов макроэргических фосфатов и сопутствующим снижением ∑AN и ∑Cr в сердце. Обнаруженные нарушения энергетического обеспечения кардиомиоцитов сочетались с глубоким снижением максимального АDP-стимулированного потребления кислорода в состоянии 3 и уменьшением функциональной активности мт-КК, оцененной в тесте с Cr. Обычно такие изменения дыхания митохондрий связывают с ограничением продукции АТP [19] и увеличением образования АФК [20]. Действие СТЗ-индуцированного диабета сопровождалось увеличением уровня циркулирующих КK-MB и ЛДГ, что свидетельствовало о повреждении миокарда. Повышенная активность КК-МВ и ЛДГ в плазме была обнаружена ранее на моделях диабетической кардиомиопатии, вызванной введением СТЗ лабораторным животным [21], и у пациентов с диабетом [22]. Последующая региональная ишемия и реперфузия сердца у крыс, получавших СТЗ, вызывала увеличение некротического повреждения ЛЖ (до 25.6%) и значительное возрастание активности обоих маркеров некроза в плазме по сравнению с диабетическими животными. Некротическая гибель кардиомиоцитов в ЗР сопровождалась ухудшением дыхательной функции митохондрий, бóльшими потерями ATP и ∑AN, чем у крыс с диабетом, и снижением АЭЗ кардиомиоцитов к окончанию реперфузии. Следует отметить, что совместное воздействие СТЗ и ИР существенно увеличивало размеры инфаркта, выраженные отношением ИМ/ЗР (%), по сравнению только с одной региональной ишемией и реперфузией.

Настоящая работа впервые продемонстрировала защитное действие введения G в начале реперфузии после периода региональной ишемии у крыс с СД1. G существенно уменьшал размеры ИМ и активность КК-МВ в плазме этих крыс по сравнению с животными диабетической группы Д+ИР. Эти эффекты могли быть обусловлены в том числе снижением дисфункции митохондрий, на что указывает увеличение ADP-стимулированного дыхания в состоянии 3, ДК и улучшение функционального сопряжения мт-КК с ОФ. В результате происходило повышение уровня АТP, ∑AN и АЭЗ кардиомиоцитов и лучшее сохранение ∑Cr в ЗР. Ранее мы обнаружили способность G уменьшать реперфузионное повреждение сердца крысы in situ, которая выражалась в ограничении размеров ИМ и снижении повреждения мембран кардиомиоцитов [23]. Она была связана со снижением образования активных форм кислорода (АФК) и продуктов ПОЛ в реперфузированном миокарде. В настоящей работе избыточная продукция АФК и ПОЛ, индуцированная диабетической гипергликемией и последующей региональной ишемией и реперфузией сердца, могла быть ведущей причиной дисфункции митохондрий и некротической гибели клеток [24]. Не исключено, что защитное действие G может быть обусловлено его антиоксидантными свойствами – усилением экспрессии генов SOD, СAT и GSH-Px, кодирующих ферменты системы антиоксидантной защиты сердца, и/или способностью перехватывать АФК и ингибировать ПОЛ [12, 23].

Помимо регуляции свободнорадикальных процессов, активация G различных путей сигнализации при связывании с рецепторами GalR1-3 может способствовать уменьшению повреждения клеток [10]. Это принципиально важно, поскольку диабет нарушает внутриклеточные сигнальные каскады, активируемые RISK-киназами, ответственные за повышение резистентности клеток к повреждениям и прежде всего сигнальный путь PI3K/Akt [2, 3]. Основные звенья внутриклеточного сигналинга, активируемого G, показаны в Приложениях (рис. S4). Наиболее физиологически значимые из них приводят к стимуляции захвата глюкозы кардиомиоцитами, ингибированию проапоптотических белков BAD/BAX, каспазы-3 и каспазы-9, блокированию открытия митохондриальной поры временной проницаемости (mPTP) и увеличению экспрессии рецепторов, активируемых пролифераторами пероксисом (PPAR). Запуск этих адаптационных механизмов имеет решающее значение в условиях сниженной продукции АТP при диабете и реперфузии сердца [25]. Как известно, снижение апоптоза кардиомиоцитов в моделях in vivo сопровождается ограничением размеров ИМ и улучшением сократительной функции сердца [26], ингибирование открытия mPTP способствует выживанию и подвижности клеток [27], а экспрессия PPARγ стимулирует поглощение и окисление глюкозы кардиомиоцитами [28]. На рецепторную природу действия G указывает и тот факт, что блокада рецептора GalR2 селективным антагонистом М871 при ИРП сердца значительно ослабляла защитный потенциал G, увеличивая размеры ИМ и активность маркеров некроза в плазме [11]. В этом контексте важно, что действие полноразмерного галанина, связывающегося со всеми подтипами его рецепторов GalR1-3, воспроизводится N-концевыми природными и модифицированными фрагментами G, обладающими высокой аффинностью к GalR2 [10]. Это указывает на потенциальную роль активации GalR2 для лечения/профилактики ИРП миокарда у пациентов с СД.

 

Рис. 4. Параметры митохондриального дыхания в скинированных сапонином волокнах ЛЖ в присутствии 10 мМ глутамата и 5 мМ малата. А – скорость потребления кислорода в состоянии 2 (V2); Б – скорость потребления кислорода в состоянии 3 (V3); В – дыхательный контроль ДК = V3/V2; Г – степень связывания мт-КК с ОФ (VCr-VADP)/VADP, %). Значения представлены как M+m для групп из пяти животных. p < 0.05 по сравнению с: *К; # Д; ^ ИР; + Д+ИР

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа подтверждает влияние стрептозотоцинового диабета на восприимчивость миокарда крыс к ИРП. Показано, что в этих условиях введение G при возобновлении реперфузии значительно снижало ИМ. Этот эффект связан с запуском внутриклеточной сигнализации через сопряженные с G-белками трансмембранные рецепторы GalR1, GalR2 и GalR3 (рис. 5). Защитное действие G проявлялось в уменьшении дисфункции митохондрий, результатом которой было улучшение энергетического состояния реперфузированной области миокарда. Эти положительные сдвиги в энергетике миокарда сопровождались снижением повреждения клеточных мембран. В целом, полученные результаты указывают на потенциальную возможность применения G в качестве дополнительной терапии при CД1 с ИРП миокарда. В связи с этим дальнейшее изучение молекулярных механизмов снижения реперфузионного стресса в диабетическом сердце с помощью природных и модифицированных пептидов галанина представляется важной задачей.

 

Рис. 5. Активация внутриклеточной сигнализации G при стрептозотоциновой гипергликемии у крыс снижает митохондриальную дисфункцию, улучшает энергетическое состояние миокарда и уменьшает повреждения клеточных мембран в зоне риска реперфузированного сердца, что приводит к уменьшению размеров инфаркта

 

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 18-015-00008) и Минздрава РФ (НИОКТР 121031700143-1).

Все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующих раскрытия в данной статье.

Приложения доступны на сайте https://doi.org/10.32607/actanaturae.27506.

Об авторах

И. М. Студнева

Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии им. акад. Е.И. Чазова МЗ РФ

Email: olpi@live.ru
Россия, 121552, Москва

Л. И. Серебрякова

Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии им. акад. Е.И. Чазова МЗ РФ

Email: olpi@live.ru
Россия, 121552, Москва

О. М. Веселова

Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии им. акад. Е.И. Чазова МЗ РФ

Email: olpi@live.ru
Россия, 121552, Москва

И. В. Доброхотов

Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии им. акад. Е.И. Чазова МЗ РФ

Email: olpi@live.ru
Россия, 121552, Москва

М. Е. Палькеева

Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии им. акад. Е.И. Чазова МЗ РФ

Email: olpi@live.ru
Россия, 121552, Москва

Д. В. Авдеев

Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии им. акад. Е.И. Чазова МЗ РФ

Email: olpi@live.ru
Россия, 121552, Москва

А. С. Молокоедов

Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии им. акад. Е.И. Чазова МЗ РФ

Email: olpi@live.ru

121552, Москва

Россия

М. В. Сидорова

Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии им. акад. Е.И. Чазова МЗ РФ

Email: olpi@live.ru
Россия, 121552, Москва

О. И. Писаренко

Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии им. акад. Е.И. Чазова МЗ РФ

Автор, ответственный за переписку.
Email: olpi@live.ru
Россия, 121552, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы